Citometría de flujo

El impacto de cada célula con el rayo de luz será captado por distintos detectores, produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la célula, pudiendo medirse así las características de dispersión de luz y fluorescencia de una suspensión celular. Estos detectores convierten dichas señales en señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida simultánea de varios parámetros en una misma célula.

En el momento de realizar las mediciones en el citómetro de flujo, las células pueden estar vivas o fijadas, pero obligadamente en suspensión celular y en forma de célula única. Al obligarlas a pasar alineadas una a una frente a un haz láser mediante un flujo continuo, cada célula, a la vez que dispersa la luz, emite luz fluorescente como consecuencia de la excitación láser a la que es sometida.

Los parámetros que típicamente se miden de forma simultánea por cada célula son:

1. la dispersión frontal de la luz (forward scatter), que tendrá un valor proporcional al tamaño celular;
2. dispersión de la luz ortogonal (side scatter) que será representativo de la cantidad de estructuras granulares o complejidad de la célula
3. y la medición de la fluorescencia, emitida a diferentes longitudes de onda, en función de los fluorocromos con los que se hayan marcado las células.

Si el análisis incluye la detección de fluorescencia hablamos estrictamente de citofluorímetros de flujo, conocidos como “citómetros” o “FACS” (por «Fluorescence Analizer Cell Sorter»). Los citómetros de flujo pueden analizar partículas en función de su fluorescencia y tamaño, y serán denominados “separadores” o “sorters” cuando además de medir estas diferencias entre poblaciones celulares, pueden purificarlas en función de sus características previamente determinadas, como sería el caso del semen sexado.

Los citómetros de flujo están formados por complejos sistemas fluídicos, óptica láser, detectores electrónicos, convertidores analógico-digitales y digitales, y ordenadores.

Los sistemas ópticos permiten el enfoque láser en un haz con un diámetro reducido para impactar sobre el menor número de partículas posibles simultáneamente. El sistema fluídico permite un enfoque hidrodinámico del flujo celular hasta conseguir el alineamiento de las partículas o células, y en los separadores celulares o «cell sorters», se produce una rotura del flujo en gotas de tamaño uniforme para conseguir la separación de células individuales. El sistema electrónico se encarga de la cuantificación de los destellos de fluorescencia y de la luz dispersada y, bajo el control del ordenador, se consigue la carga electrónica de las gotas que contienen las células de interés para poder someterlas a deflección y recogerlas en tubos específicos para tal fin, o sobre pocillos de cultivo de tejidos. El ordenador permite almacenar datos de miles de células por cada muestra, y representar los resultados gráficamente. La citometría de flujo presenta una mayor sensibilidad en los análisis en comparación con la microscopía de fluorescencia y las técnicas citoquímicas.

Entre sus ventajas cabría destacar:

1. la posibilidad de un mayor número de marcajes por cada célula,
2. el análisis de un elevado número de partículas en un corto periodo de tiempo (5000 partículas por segundo),
3. cuantificación de la/s respuesta/s de las muestras por medio de la fluorescencia,
4. análisis individualizado de cada uno de los componentes de una población celular,
5. almacenamiento de la información detectada para su posterior utilización y reanalizar datos tomados con anterioridad.

Los sorters utilizados para separar espermatozoides en función de si portan el cromosoma X o el cromosoma Y, se basan en la detección del contenido en ADN de cada espermatozoide, mediante su tinción con un fluorocromo, Hoechst 33342, que penetra a través de la membrana celular del espermatozoide y se une específicamente al ADN. De este modo, a los espermatozoides que contengan el cromosoma X se les habrá unido un 3.8% más de fluorocromo que a los que porten el cromosoma Y. Este fluorocromo emite fluorescencia cuando es expuesto a un haz de luz emitida por un láser con una determinada longitud de onda, produciendo la excitación del fluorocromo, pero sin dañar la célula. Así, la fluorescencia emitida por el Hoechst 33342, que se encuentra unido al ADN de los espermatozoides, será medida por un detector y analizada por el software que acompaña al citómetro de flujo. La fluorescencia emitida por los espermatozoides que contienen un cromosoma X será, aproximadamente, un 4% mayor que en los que posean el cromosoma Y.

Figura: funcionamiento de un sorter para sexaje de semen.

1. El sistema fluídico del citómetro, por medio del fluido isotónico, produce una corriente celular donde los espermatozoides discurrirán aisladamente, incluidos en gotas del diluyente, y pasarán frente al haz del láser de uno en uno.
2. Conforme los espermatozoides atraviesan el rayo de luz, interaccionan con este causando su dispersión, que será registrada por los detectores. En este punto, los espermatozoides X producirán más fluorescencia que los espermatozoides Y.
3. Una vez detectadas estas dos poblaciones de espermatozoides, la computadora asignará carga positiva o negativa, en función de su sexo, a los espermatozoides que han podido clasificarse, mientras que la población no clasificable no presentará carga alguna y será almacenada separadamente.
4. Las gotas que contienen los espermatozoides son desviadas en función de la carga que se les ha asignado (+, -, o sin carga), pasando a distribuirse en tres grupos diferentes.