PCR cuantitativa

Para validar un protocolo de PCR con el objetivo de realizar cuantificaciones, se debe elaborar una recta de regresión a partir de concentraciones conocidas y decrecientes de ADN diana, estimando a partir de esta recta tres parámetros principales: eficiencia, coeficiente de correlación y rango dinámico.

• Eficiencia (E): se define como la capacidad del protocolo de PCR diseñado de duplicar la cantidad de ADNc molde disponible en cada ciclo, y se expresa en porcentaje. Un 100 % significaría que en cada ciclo se copia todo el ADNc del ciclo anterior.

• Coeficiente de correlación (r): ajuste de los datos a la recta de regresión construida, que determina si el protocolo es reproducible.

• Rango dinámico del ensayo: es el rango de concentraciones entre las que funciona correctamente el protocolo. Teniendo en cuenta que en PCR cuantitativa no es posible extrapolar los resultados, el rango nos indica la concentración más alta y más baja donde el protocolo de PCR se comporta realmente de forma cuantitativa y las muestras se pueden medir.

Un protocolo de PCR cuantitativa se acepta como válido cuando los parámetros obtenidos son del orden de E ≥ 80% y r ≥ 0,95 dentro del rango dinámico establecido ( Ver figura).

Con la herramienta presentada por Agilent Technologies, podrás calcular la eficiencia de la PCR a tiempo real introduciendo el valor de la pendiente de la ecuación de la recta.

Figura. Recta de regresión para la estimación de los parámetros principales de un protocolo de PCR a tiempo real. Representación gráfica de los niveles de expresión (Ct) de diversas diluciones seriadas de muestras control o standards estudiadas por triplicado y ubicación de los niveles de expresión de diferentes muestras (unknowns) en el rango dinámico de la PCR.