PCR en Tiempo Real

La PCR en tiempo real (Real Time PCR) fue descrita originalmente con el nombre de “Kinetic PCR” por Higuchi y cols., (1993). Es una variante de la PCR convencional que se basa en la detección y cuantificación simultanea de la fluorescencia emitida por los productos de PCR que se acumulan durante el proceso de amplificación.

Debido a la elevada sensibilidad de la técnica, uno de los puntos más importantes a la hora de realizar una PCR en tiempo real es la calidad del material de partida. Por ello, la correcta extracción de los ácidos nucleicos de la muestra es fundamental. Aunque en los últimos años se han hecho grandes progresos en la simplificación de la extracción y purificación de los ácidos nucleicos todavía no se ha encontrado un método universal que se pueda utilizar con cualquier tipo de muestra.

En la PCR a tiempo real, los procesos de amplificación y detección se producen de manera simultánea en el mismo vial cerrado, sin necesidad de ninguna acción posterior. Además, mediante detección por fluorescencia se puede medir la cantidad de ADN sintetizado en cada momento durante la amplificación, ya que la emisión de fluorescencia producida en la reacción es proporcional a la cantidad de ADN formado. Esto permite conocer y registrar en todo momento la cinética de la reacción de amplificación.

Para llevar a cabo la PCR a tiempo real, los termocicladores incorporan un lector de fluorescencia y están diseñados para poder medir, en cualquier momento, la fluorescencia emitida en cada vial donde se realice la amplificación. Los sistemas de detección por fluorescencia empleados en la PCR a tiempo real pueden ser de dos tipos:

agentes intercalantes y
sondas específicas marcadas con fluorocromos.

El fluorocromo más empleado en PCR a tiempo real es el SYBR Green I. El incremento de ADN en cada ciclo se refleja en un aumento proporcional de la fluorescencia emitida. Este sistema de detección tiene la ventaja de ser más fácil y más barato que las sondas específicas. El principal inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad, debido a que se unen de manera indistinta a productos generados inespecíficamente y a dímeros de oligonucleótidos, estos últimos muy frecuentes en la PCR. La especificidad de la reacción aumenta en condiciones de realización óptimas y con la selección cuidadosa de los oligonucleótidos, lo que disminuye el riesgo de formación de dímeros.

Figura. Funcionamiento de Sybr Green. Este agente intercalante en el ADN no presenta capacidad de unión a ácidos nucléicos de cadena sencilla. Una vez que la polimerasa comienza a copiar el ADN, el Sybr Green puede situarse en la doble cadena, emitiendo fluorescencia cuando haya sido excitado por una fuente emisora de luz, situada en el termociclador. (Primer es el oligonucleótido o cebador de la RTPCR).
Figura modificada de Methods for measuring mRNA levels. http://homepages.strath.ac.uk/

Referencia:Higuchi R, Fokler C, Dollinger G, Watson R. (1993) Kinetic PCR analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology; 11: 1026-1030.