Recuento celular en blastocistos: Tinción diferencial
Una técnica sencilla que permite realizar el recuento de las células de la masa celular interna (MCI) y del trofectodermo de blastocistos es la técnica de tinción diferencial descrita por Thouas y cols., (2001). Para ello se utilizan dos fluorocromos, ioduro de propidio (IP) y bisbenzimida (Bb), que se intercalan en el ADN de doble cadena. La Bb penetra en todas las células, mientras que el IP requiere una permeabilización previa de la membrana celular.
Protocolo:
Incubar durante 30 segundos en la siguiente solución: (atemperar la solución a 37 ºC previamente, para evitar que el embrión se colapse).
• TCM‐199 (Gibco®, Barcelona; 500 μl)
• Hepes (25 mM)
• Triton X‐100 (1%)
• IP (100 μg/ml)
Inmediatamente pasar los embriones a una solución para su fijación y la tinción de los núcleos:
• Etanol (500 μl)
• Bb (Sigma® Hoeschst 33342; 25 μg/ml)
Conservar la muestra protegida de la luz.
Tras una incubación a 4 °C durante una noche, los blastocistos se recuperan de la solución de etanol y se sitúan sobre un portaobjetos en una pequeña gota de glicerol.
Para la correcta observación del embrión, debe colocarse cuidadosamente el cubreobjetos, ejerciendo la presión necesaria para dejar las células del embrión en un solo plano, facilitando así el recuento celular.
Una vez colocado el cubreobjetos y sellado, las muestras fueron observadas en un microscopio de fluorescencia. Ambos tipos celulares se observaron con el mismo filtro, con un espectro de excitación de 330 a 385 nm y un filtro barrera de 420 nm.
Las células del trofectodermo componen la parte más externa del blastocisto y, debido a la permeabilización, incorporan los dos fluorocromos (IP y Bb) emitiendo fluorescencia de color rosa.
Por otra parte, las células de la MCI no permeabilizadas, únicamente permiten la entrada de Bb, emitiendo fluorescencia de color azul.
Figura. Tinción diferencial de un blastocisto bovino expandido de día 7 según el protocolo de Thouas y cols., 2001.
Referencia:
Thouas GA, Korfiatis NA, French AJ, Jones GM, Trounson AO. Simplified technique for differential staining of inner cell mass and trophectoderm cells of mouse and bovine blastocysts. Reprod Biomed Online 2001;3:25–9.
